La princesse Iolanta, aveugle de naissance, vit recluse dans un jardin secret du palais de son père, le roi René. Toute sa vie, sa cécité et son statut royal lui sont cachés. Bertrand, le jardinier, et sa femme Martha, sa nourrice, l’élèvent et s’efforcent de la rendre heureuse, mais Iolanta sent qu’il lui manque quelque chose, quelque chose que les autres ressentent. Le roi insiste pour que sa cécité reste secrète, non seulement pour elle, mais aussi pour son fiancé, le duc Robert. Un médecin maure, Ibn-Hakia, arrive au jardin avec le roi et lui affirme pouvoir guérir Iolanta, mais pour cela, elle doit d’abord prendre conscience de sa cécité, car il croit que « le corps et l’âme ne font qu’un ». Le roi, craignant de briser le cœur d’Iolanta si le traitement échoue, refuse sa proposition.

Robert arrive au palais avec son ami le comte Vaudémont et lui confie son intention de rompre ses fiançailles avec Iolanta, car il est tombé amoureux d’une autre femme. En flânant dans le parc du palais, ils découvrent l’entrée du jardin secret où vit Iolanta et y pénètrent, malgré les panneaux d’avertissement. Ils la voient endormie, et Vaudémont tombe amoureux d’elle sans savoir qui elle est. Robert, choqué par le comportement de son ami, la prend pour une sorcière qui l’a ensorcelé. Il ordonne à Vaudémont de partir, mais face à son refus, Robert part chercher des soldats pour le secourir. Iolanta se réveille, et Vaudémont, qui lui demande une rose rouge en souvenir, comprend qu’elle est aveugle lorsqu’elle lui tend deux roses blanches. Il lui explique alors la nature de la lumière et des couleurs, et ils tombent amoureux. Le roi les surprend ensemble, et Vaudémont déclare son amour à Iolanta, qu’elle soit aveugle ou non. Ibn Hakia informe le roi que, maintenant qu’Iolanta est consciente de sa cécité, le traitement peut commencer. Cependant, Iolanta, quant à elle, ne ressent aucun manque et hésite à se soumettre à l’intervention.

Vaudémont avoue au roi avoir aperçu les signes avant-coureurs avant d’entrer dans le jardin, et le roi le menace de mort pour avoir révélé la cécité d’Iolanta. Il lui annonce que Vaudémont sera exécuté si le médecin ne parvient pas à la guérir. Horrifiée, Iolanta accepte le traitement. Tandis qu’Iolanta et le médecin s’en vont, le roi confesse à Vaudémont qu’il n’a jamais eu l’intention de procéder à l’exécution ; il a seulement proféré cette menace pour inciter Iolanta à se faire soigner. Entre-temps, Robert revient avec les soldats et avoue au roi être amoureux d’une autre femme, tout en se disant prêt à honorer le mariage arrangé. Le roi annule l’accord et autorise Iolanta à épouser Vaudémont. Iolanta et Ibn-Hakia reviennent après le succès du traitement, et Iolanta a recouvré la vue. D’abord un peu bouleversée, elle se réjouit rapidement de ce don et du monde nouveau qui s’offre à elle.